病毒DNA/RNA提取試劑盒

QIAampR UltraSens^TM Virus Handbook

廣州健侖生物科技有限公司

（用于從1ml懸液樣品中高效純化可濾性病毒RNA或DNA）

1 試劑盒（250份）

純化柱	250
接收管 2ml	750
AC 緩沖液	230 ml
AR* 緩沖液	90 ml
AB 緩沖液(濃縮)	22 ml
AW1* 緩沖液(濃縮)	95 ml
AW2* 緩沖液(濃縮)	66 ml
AVE 緩沖液	10×2 ml
蛋白酶K	6 ml
Carrier RNA	5×310 μg

2 保存

2.1 純化柱室溫保存（15—25 ℃，以下室溫保存均指該溫度），保質(zhì)期12個(gè)月

2.2干粉狀Carrier RNA 可室溫保存1年；而溶于AVE緩沖液時(shí)需要等分，可于-20℃保存1年

2.3 蛋白酶溶液可室溫保存1年，但于2—8℃環(huán)境下可延長(zhǎng)保存期

3 安全

3.1 衣著：合適的實(shí)驗(yàn)室外套、一次性醫(yī)用手套、護(hù)目鏡

3.2 注意事項(xiàng)

3.2.1 勿將漂白劑或酸溶液直接加入樣品準(zhǔn)備廢液中，當(dāng)AR緩沖液和AW1緩沖液含有的胍氫可酮和漂白劑結(jié)合時(shí)會(huì)產(chǎn)生高敏性的有害混合物

3.2.2 緩沖液AC、AB、AR、AW1和蛋白酶K均具潛在危險(xiǎn)性，操作時(shí)需認(rèn)真謹(jǐn)慎

3.2.3 所有實(shí)驗(yàn)步驟均需在室溫（15—25℃）下進(jìn)行；樣品液可于2—8℃下保存6小時(shí)，在-20℃或-80℃下保存更長(zhǎng)時(shí)間；同時(shí)，樣品需先用內(nèi)部控制物處理，以防核酸酶降解

3.2.4 純化柱（防交叉污染）

3.2.4.1 加入樣品液時(shí)勿弄濕柱子邊緣

3.2.4.2 注意更換有屏障的無(wú)核酸酶槍頭

3.2.4.3 防止用槍頭觸碰柱膜

3.2.4.4 稍離心除去蓋上液滴

4、設(shè)備與試劑

4.1 乙醇（96—100%）

4.2 無(wú)菌、無(wú)核酸酶、有屏蔽的槍頭

4.3 無(wú)核酸酶離心管（1.5ml和2ml）

4.4 一次性無(wú)粉手套

4.5 磷酸鹽緩沖液（PBS,當(dāng)樣品樣不足1ml時(shí)）

4.6 可調(diào)速微型離心機(jī)（250—1200_×g）

4.7 振搖孵育器，可加熱

4.8試劑準(zhǔn)備

4.8.1 Carrier RNA

    每管加入310μl緩沖液AVE，制成1μg/μl 溶液，-20℃保存（凍融不能超過(guò)3次），每樣品最優(yōu)Carrier RNA量為5.6μg

4.8.2 緩沖液AB

加入標(biāo)明的乙醇體積（96—100%），翻轉(zhuǎn)10次，使得溶液均質(zhì)，室溫保存

4.8.3 緩沖液AW1^*

加入瓶上標(biāo)明的乙醇體積（96—100%），室溫保存

4.8.4 緩沖液AW2^*

加入瓶上標(biāo)明的乙醇體積（96—100%），室溫保存

5、流程

5.1 1ml處理液

5.2 細(xì)胞溶解，目標(biāo)物沉淀于緩沖液AC中

5.3 在緩沖液AR中重新懸浮，并用蛋白酶K除去蛋白

5.4 加入緩沖液AB，連接，清洗2遍，洗提獲得RNA或DNA

6、實(shí)驗(yàn)操作步驟

6.1 準(zhǔn)備

6.1.1 使樣品液溫度平衡至室溫（15—25℃）

6.1.2 校核緩沖液AB、AW1、AW2、Carrier RNA等

6.1.3 使AR緩沖液溫度平衡至60℃（水浴鍋）

6.1.4 所有離心操作需在室溫下進(jìn)行

6.2 吸取1ml 樣液至2ml 離心管中（管蓋上不能有液體粘附，防污染）

若不足1ml，需用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足，但樣液體積應(yīng)不少于200μl

6.3 吸取0.8ml 緩沖液AC至樣液表面；吸取5.6μl Carrier RNA液體至管蓋（6.1μl mix）勿將緩沖液AC和Carrier RNA事先混合，且需加入內(nèi)部控制物，同時(shí)推薦與Carrier RNA混合加入（0.5μl + 5.6μl Carrier RNA），即6.1μl mix

6.4 蓋上蓋子，上下翻轉(zhuǎn)3次，渦旋10秒

6.5 室溫孵育10分鐘（最多15分鐘，不能更久）

6.6 離心3分鐘（1200_×g），移除表面液體，收集沉淀（輕彈使沉淀松散，確保蓋上無(wú)碎物）

6.7 移入300μl 預(yù)熱至60℃的緩沖液AR和20μl 蛋白酶K

   為了減少移液步驟，可將緩沖液與蛋白酶K混合，若10份，即3.3ml預(yù)熱緩沖液AR和220μl蛋白酶（多10%），漩渦10秒混合后，分裝320μl至每管

6.8漩渦至微粒完全重新懸浮

   每次漩渦兩管（5—10秒），后漩渦另兩管，反復(fù)循環(huán)3—5次（或更多），有助于蛋白消化

6.9 在振搖孵育器上孵育10分鐘，40℃，最高混勻速度

    10分鐘已足夠長(zhǎng)，不允許延長(zhǎng)時(shí)間

6.10 稍離心，除去蓋上液滴

6.11 移入300μl 緩沖液AB，漩渦混勻，稍離心

6.12 小心移取700μl溶解物至純化柱（裝在一2ml收集管上），勿弄濕邊緣，蓋上蓋子，離心1分鐘（3000—5000×g）

6.13 將純化柱裝在新的2ml收集管上（試劑盒中提供），遺棄舊收集管；小心打開(kāi)純化柱蓋子，移入500μl緩沖液AW1；離心1分鐘（6000×g）

6.14 將純化柱裝在新的2ml收集管上（試劑盒中提供），遺棄舊收集管；小心打開(kāi)純化柱蓋子，移入500μl緩沖液AW2；最高速離心3分鐘（20,000×g）

為防止離心減速震動(dòng)導(dǎo)致的濾液黏著在純化柱上，可額外取一新2ml收集管套上純化柱，最高速離心1min

6.15將純化柱裝在新的1.5ml收集管上（非試劑盒中提供）遺棄舊收集管；小心打開(kāi)純化柱蓋子，移入30μl緩沖液AVE至純化柱膜上（全部弄濕），離心1分鐘（6000×g）

6.16 重復(fù)步驟6.15，當(dāng)需更多體積時(shí)，可適當(dāng)增加AVE體積，而非提取后稀釋

6.17 RNA保存，-80℃

備注：初步計(jì)算，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程共需約2—3小時(shí)

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