一 、試劑盒內(nèi)含物

.說明書亞洲 1 型口蹄疫陽性對照血清( 己稀釋濃度為 1:8)

.96 孔 ELISA 板亞洲 1 型口蹄疫陰性對照血清

.液體稀釋槽3% 雙氧水

.U 型96孔抗原抗體反應(yīng)板25×PBST洗滌液(稀釋時準(zhǔn)確量取)

.封板膜豚鼠抗血清稀釋液

.滅活亞洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原 (用冰決包裹 )終止液

.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被緩沖液(碳酸鹽)膠囊

.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物 (檸檬酸 -磷酸鹽)緩沖液片劑

.兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物OPD片劑

二、器材準(zhǔn)備 ( 需用戶自備 )

 1.移液器:5-50μl移液器、0.2—10μl移液器、50—200μl移液器、50—300μl 12道移液器各一把。

 2.移液槍尖 (若干)。

 3.抗原抗體反應(yīng)板:微量血凝板(U型、V型均可)5塊,本試劑盒配備兩塊,用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注:抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用,實驗后,用水沖洗干凈,然后用無離子水沸水浴30秒,晾干,待用。

 4.超純水 , 無離子水或蒸餾水。

三、試劑準(zhǔn)備(需用戶完成)

1.包被緩沖液(PH9.6)

   將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開,將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4℃存放,1月內(nèi)有效。

2. 洗滌液(PBST)

   將本試劑盒配備的 25 倍濃縮 PBST 液(可能有結(jié)晶形成,用時微熱溶化)用無離子水或蒸餾水做1:25稀釋。(如果PH降低,務(wù)必用NaOH調(diào)至7.4)

3.底物溶液

  取1片檸檬酸—磷酸鹽片劑(本試劑盒配備)溶于100mL無離子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片鄰苯二胺(OPD)片劑,充分溶解,分裝（5mL/ 瓶或 10Ml∕瓶 ), 避光之-2O℃保存。用前避光溶化 ,臨時每1mL上述溶液加 10μL本試劑盒配備的 3% 的雙氧水(H₂0₂) 。務(wù)必加雙氧水!

四、操作步驟

 1.用包被緩沖液稀釋亞洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50μl, 振蕩 , 封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。

2. 抗原抗體(陰陽性對照血清及待檢血清)反應(yīng)

根據(jù)不同的需要,選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應(yīng)板上操作。

圖196 孔酶標(biāo)板檢測 10 份樣品布局圖

S1 1:8	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	+1:32	-1:4
1:16										1：64	1:8
1:32										1：128
1:64										1：256
1:128										1：512
1:256										1:1024
1:512										1:2048
1:l024										1:4096

圖1 為抗體滴度測定 (定量) 檢測 10 份樣品布局圖;圖 2 為抗體滴度測定( 定量 )檢測 20 份樣品布局圖。

圖296 孔酶標(biāo)板檢測 20 份樣品布局圖

S11:32	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	+1:32	-1:4
1:64										1:64	1:8
1:128										1:128
1:256										1:256
S111:32	S12	S13	S14	S15	S16	S17	S18	S19	S20	1:512
1:64										1:1024
1:128										1:2048
1:256										1:4096

以圖1 為例 , 在 U 型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 將待檢 血清從1:4開始做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時,按圖示稀釋陰陽性對照血清 , 然后每孔加入 50 μl用 PBST 稀釋到使用濃度的亞Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原對照孔加100μl。振蕩混勻,封板,4℃過夜。加入病毒抗原后血清的稀釋度變?yōu)閺?/span>1:8開始的2倍稀釋。

3.用洗滌液 (1×PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水紙上甩干,再將抗原抗體混合物從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對應(yīng)孔,每孔50μl封板,37℃溫育1小時。

4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度 (1:1000), 每孔加50μl,封板,37℃溫育1小時。

5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 l×PBST 稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度 (1:500), 每孔加 50 μl封板 ,37 ℃溫育 1 小時。

6. 同上洗板5次,每孔加50μl底物溶液 (務(wù)必加雙氧水),37℃溫育15分鐘。每孔再加50μl終止液終止反應(yīng),立即在492nm波長下讀取光吸收值(OD_492nm值)。

五、結(jié)果判定

1. 試驗認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)

每塊板設(shè) 4 孔病毒抗原對照,病毒抗原對照不加任何血清,直接用PBST稀釋至使用濃度,與血清/病毒抗原復(fù)合物同步加入ELISA板孔,50μl/孔,病毒抗原對照OD492nm 值應(yīng)在1.5±0.5范圍內(nèi)。 陽性對照抗體效價應(yīng)在1:1024±1滴度以內(nèi),陰性對照血清抗體效價應(yīng)＜1:8。

2.病毒抗原對照平均OD492nm 值50%計算(臨界值)

抗原對照是4孔,棄去最高和最低OD492nm值,計算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對照OD492nm值。

3.結(jié)果判定

以病毒抗原對照平均OD492nm 值的50%為臨界值,被檢血清稀釋孔OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔,小于或等于臨界值的孔為陽性孔,陽性孔的OD492nm值等于臨界值時所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均OD492nm值為1.2,則其50%為0.60。若某一待檢血清在1:128時OD492nm值為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個滴度之間 ,如處于1：64與1：128之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測中 , 兩個重復(fù)孔只要有 一孔為陽性孔 , 則抗體滴度判 定為 1:128, 兩孔均為陽性孔 , 則判定 為抗體滴度＞1:128 。

ELISA抗體效價≥1:128,判定為亞洲 1 型口蹄疫抗體陽性。

ELISA抗體效價與保護力的關(guān)系:牛、羊:抗體效價≥1:128,99% 保護；效價≤1:16, 不保護；效價在1:22-90之間,50%保護。

豬瘟正向間接血凝試驗試劑使用說明書

一、原理

用己知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗，稱為正向間接血凝試驗，亦稱間接血凝。抗原與其對應(yīng)的抗體相遇，在一定條件下形成抗原——抗體復(fù)合物。但這種復(fù)合物的分子團很小人肉眼看不見。將抗原吸附(致敏)在紅細(xì)胞表面，制成豬瘟血凝抗原，用于檢測免疫動物血清中的豬瘟抗體水平。

這種經(jīng)過豬瘟抗原致敏的紅細(xì)胞與豬瘟抗體相遇，紅細(xì)胞便出現(xiàn)清晰的凝集現(xiàn)象。

二、適用范圍

主要用于檢測豬瘟免疫抗體效價，以便制定正確的免疫程序，保障豬群免遭豬瘟強毒的感染。

三、試驗器材，

1、96孔110^。V型醫(yī)用血凝板，與血凝板大小相同的玻板。

2、1微量移液器(50微升、25微升)取液塑料咀。

3、微量振蕩器。

4、豬瘟血凝抗原

5、豬瘟陰性對照、血清。

6、豬瘟陽性對照血清。

7、稀釋液。

8、待檢血清（每頭約0.5ml血清即可）。

四、試驗方法

1、加稀釋液

在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔第6孔；第8排的1～12孔各加稀釋液50微升。

2、稀釋待檢血清

取1號待檢血清50微升加入第1排第l孔，并將塑咀插入孔底，右手拇指指輕壓彈簧1～2次混勻(避免產(chǎn)生過多的氣泡)，從該孔取出50微升移入第2孔，混勻后取出50微升移入第3孔……直至第9孔混勻后取出50微升丟棄。此時第1排1～4孔待檢血清的稀釋度(稀釋倍數(shù))依次為:1:2（1）、1:4(2)、1:8(3)、1:16(4)、1:32(5)、1:646)、1:128(7)、1:256(8)、1:512(9)。

取2號待檢血清加入第2排:取3號待檢血清加入第3排……均按上法稀釋，注意!每取1份血清時，必須更換塑咀一個。

3、稀釋陰性對照血清

在血疑板上的第7排第1孔加陰性血清50微升，對倍稀釋至第4孔，混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為1:2(1)1:4(2)1:8(3)1:16(4)。第6孔為稀釋液對照。

4、稀釋陽性對照、血清

在血凝板上的第8排第1孔加陽性血清50微升，對倍稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時陽性血清稀釋倍數(shù)依次為1:2～1:4096。

5、加血凝抗原

被檢血清各孔、陰性對照血清各孔、陽性對照血請各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原(充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀)25微升。

6、振蕩混勻

將血凝板置于微量振蕩器上振蕩1～2分鐘，如無振蕩器；用手輕輕搖勻亦可。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或37℃下靜置1.5～2小時判定結(jié)果，也可延至翌日判定。

7、判定標(biāo)準(zhǔn)

移去玻板，將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1:16孔，稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集(血球全部沉入孔底形成邊緣整齊的小圓點)，或僅出現(xiàn)凝集(血球大部沉于孔底，邊緣稍有少量血球懸浮)。

陽性血清對照、1:2～1:256各孔應(yīng)出現(xiàn)“++～++++”凝集為合格，(少量血球沉入孔底，大部血球懸浮于孔內(nèi))。

在對照孔合格的前提下，再觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“++”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價。例如1號待檢血清1～5孔呈現(xiàn)“++～++++”凝集，6～7孔呈現(xiàn)“++”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第9孔無凝集，那么就可判定該份血清的豬瘟抗體效價為1:128。

接種豬瘟疫苗的豬群免疫抗體效價達到1:16(即第4孔)呈現(xiàn)“++”凝集為免疫合格。

五、檢測試劑性能要求

1、性狀

(l)液體血凝抗原：搖勻呈棕紅色(或咖啡色)，靜置后，血球逐漸沉入瓶底。

(2)陰性對照血清：淡黃色清亮稍帶粘性的液體。

(3)陽性對照血清：微紅或淡黃色稍混濁帶粘性的液體。

(4)稀釋液：淡黃或無色透明液體，低溫下放置，瓶底易析出少量結(jié)晶，在水浴中加溫后即可全溶，不影響使用。

2、包裝

(１)液體血凝抗原：搖勻后即可使用，5ml/瓶，每瓶檢測3040頭份血清。

(2)陰性血清：2ml/瓶，直接稀釋使用。

(3)稀釋液：100ml/瓶，直接使用4℃保存。

3、保存條件及保存期

(l)液體血凝抗原：4℃保存(切勿凍結(jié))，保存期4個月。

(2)陰性對照血清：-15～-20℃保存，有效期2年，4℃保存有效期半年。

(3)陽性對照血清:-15～-20℃保存，有效期2年，4℃保存有效期半年。

六、注意事項

1、為使您的檢測獲得正確結(jié)果，請您在檢測前仔細(xì)閱讀本說明書。

2、嚴(yán)重溶血或嚴(yán)重污染的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。

3、勿用90^。和130^。血凝板，以免誤判結(jié)果。

4、本法可單獨檢測豬瘟抗體水平，也可同步檢測口蹄疫免疫抗體水平。

5、用過的血凝板應(yīng)及時在水龍頭下沖凈血球。再用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干水份放37℃恒溫箱內(nèi)干燥備用。檢測用具應(yīng)煮沸消毒，37℃干燥備用。

6、每次檢測只做一份陰性、陽性和稀釋液對照。、

“-”表示完全不凝集或0～10%血球凝集；

“+”表示10-25%血球凝集；“+++”表示75%血球凝集；

"++"表示50%血球凝集；“++++”表示90～100%血球凝集。