1.       目的

制定沙門氏菌屬診斷血清使用程序，指導(dǎo)對(duì)沙門氏菌屬進(jìn)行血清學(xué)分型。

2.       原理

用沙門氏菌屬的代表菌株制成滅活菌抗原分別或混合免疫家兔所得的血清，經(jīng)吸收出去非特異性凝集素后制成，通過凝集試驗(yàn)原理供沙門氏菌屬常見菌型定型。

3.       試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備

3.1    沙門氏菌屬診斷血清

3.2    試劑保存：2~8°C避光保存，防止凍結(jié)，在有效期內(nèi)使用。

3.3    實(shí)驗(yàn)設(shè)備：玻片、吸樣槍、接種環(huán)、水浴箱、玻璃管、血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、電熱高溫接種滅菌器。

4.       程序步驟

4.1    將診斷血清于冰箱取出后平衡至室溫。

4.2    選擇經(jīng)初步生化檢測(cè)符合沙門菌生物特性的疑似菌落。

4.3    菌群分析

將經(jīng)18~24h血平板上純培養(yǎng)的待檢菌，先用O多價(jià)A~F群血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，如陽(yáng)性，提示待檢菌可能屬于A~F群范圍內(nèi)，因97%以上的沙門菌都包括在A~F6個(gè)O群之內(nèi)，如果不凝再使用其他O抗血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，如與其中一種抗血清凝集，待檢菌即屬于相應(yīng)的菌群。若與多價(jià)O抗血清不凝集，有如下3種可能：①含有Vi抗原；②A~FO群之外的沙門菌；③沙門氏菌屬以外的細(xì)菌。可按下述方法進(jìn)一步檢測(cè)，將純菌落用無菌生理鹽水洗下，制成濃菌液，再分成2份。1份不經(jīng)處理，為活菌液，另1份放100°C水浴中30min，為加熱菌液。取活菌與Vi抗血清，取加熱菌與Vi抗血清凝集，加熱菌與Vi抗血清、A~F多價(jià)O抗血清分別進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。根據(jù)結(jié)果作如下分析：①活菌與Vi抗血清凝集，加熱菌與Vi抗血清凝集者，可能屬于C群或D群菌，用O₇和O₉抗血清定群；②活菌與Vi抗血清不凝，可能屬于A~FO群之外的沙門菌或其他菌屬細(xì)菌，需進(jìn)行生化試驗(yàn)定屬，若符合沙門氏菌屬細(xì)菌特征，可送CDC鑒定；③加熱菌與Vi抗血清凝集，而與A~F多價(jià)O抗血清不凝集者，可報(bào)告為陰性。

4.4    血清型分析

菌群確定后，分析被檢菌的鞭毛抗原成分。先分析第1相鞭毛抗原，再分析第2相鞭毛抗原。第1相鞭毛抗原分析：根據(jù)菌群分析結(jié)果，分別選用第1相鞭毛因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。第2相鞭毛抗原分析：所用抗血清，通常是復(fù)合因子（1、2、3、5、6、e、n、I、w）血清。單相菌，如第1相已確定，可結(jié)合菌群分析及生化反應(yīng)結(jié)果判斷血清型。如為雙相菌，只分析出第1相鞭毛抗原，大多數(shù)也可結(jié)合菌群分析和生化結(jié)果判斷血清型，必要時(shí)進(jìn)一步探索第2相鞭毛抗原。若只分析出第2相鞭毛抗原，須進(jìn)一步探索分析第1相抗原。探索另1相抗原可按下述方法和步驟進(jìn)行。如“小內(nèi)管”法，一支已融化半固體瓊脂，插入一支無菌兩端相通小玻璃管于培養(yǎng)基當(dāng)中，長(zhǎng)度稍高出半固體液面。待瓊脂泠卻凝固，用接種環(huán)取1~2環(huán)待抑制相H抗血清，放入小內(nèi)管的瓊脂表面，然后接種被誘導(dǎo)菌株于小內(nèi)管含抗血清瓊脂層面，35°C孵育4~6h或過夜，取小內(nèi)管外半固體瓊脂層生長(zhǎng)培養(yǎng)物，接種于平板或直接做凝集反應(yīng)，可獲得待誘導(dǎo)相的菌株。有些種的確定是靠鞭毛抗原中的微小差異來分析的，因而獲得豐富鞭毛抗原的培養(yǎng)物十分重要。

4.5    將經(jīng)18~24h血平板上純培養(yǎng)的待檢菌，用生理鹽水制備2麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海≡\斷血清20μL于潔凈玻片上，然后取20μL待檢菌懸液與血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，1min內(nèi)呈現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性，呈均勻渾濁者為陰性，每次凝集試驗(yàn)均應(yīng)以生理鹽水作為陰性對(duì)照試驗(yàn)。

4.6    根據(jù)其生化反應(yīng)和與O抗血清、Vi抗血清、H抗血清的凝集結(jié)果對(duì)照沙門氏菌屬國(guó)內(nèi)常見菌型診斷抗原表，確定沙門菌的菌型。

4.7    沙門氏菌屬國(guó)內(nèi)常見菌型診斷抗原，見附表

5.       質(zhì)量控制

O多價(jià)A~F群血清選擇傷寒沙門菌ATCC14028為陽(yáng)性對(duì)照；大腸埃希菌ATCC25922為陰性對(duì)照

6.       質(zhì)量記錄

7.       參考文獻(xiàn)

[1]     盧錦漢主編.醫(yī)學(xué)生物制品學(xué).北京.人民衛(wèi)生出版社.1995

[2]     中國(guó)生物制品規(guī)程（2000年版）.北京.化學(xué)工業(yè)出版社.2000

附表：沙門氏菌屬國(guó)內(nèi)常見菌型診斷抗原表